古籍《中庸大学》污染霉菌的鉴定及其纸质样品

0 引言

自人类发明了纸张，文明的发展、文化的传播便进入了崭新的历史阶段.中华文明源远流长博大精深，研究保护好传统文化是我们责无旁贷的责任，古籍正是这些传统文化遗产的重要载体，保护好、传承好、利用好古籍，对于发展文化自信、建设中国特色社会主义文化事业、铸就中华文化新辉煌具有重大意义[1].但是不能回避的问题是这些古籍的长久保存却受到各种因素的影响[2-3]，其中作为空气中数量众多的气传生物学微粒的霉菌孢子在空气中的数量可达到20万个/m3[4]，这些孢子以纸张为营养物质大量繁殖，对其造成变色、粘连、机械强度下降等损伤，严重者甚至可使其腐烂直至变成“档案砖”，造成不可挽回的损失.为此，从现代生物学角度出发，对辽宁大学图书馆馆藏古籍上霉菌进行科学采样、复苏、鉴定[5]，与此同时利用仿古宣纸为材料，设计方案将古籍上采得菌样复制模拟，进而使用生物酶清洗剂对模拟样品进行清洗，从中筛选最优方案，以期为古籍防霉治霉工作提供更加可靠方案.

1 材料与方法

1.1 材料、试剂

模拟用纸：仿古宣纸；

木瓜酶，Merck & Co Inc；葡萄糖，琼脂，抗坏血酸，巯基乙醇，国产分析纯；真菌试剂盒，上海生工生物工程技术服务有限公司；核酸染料，宝生物工程有限公司；DNA Marker，宝生物工程有限公司；DDH2O，上海生工生物工程技术服务有限公司；

上游引物为NS1：5′-GTAGTCATATGCTTGTCTC-3′，下游引物为NS8：5′-TCCGCAGGTTCACCTACGGA-3′，以上均由上海生物工程有限公司合成[6-7].

1.2 仪器与设备

立式压力蒸汽灭菌器，上海博迅实业有限公司；电热恒温培养箱 DNP-9082 型，上海跃进医疗器械有限公司；台式恒温振荡器，Blue Pard；高速冷冻离心机，科大创股份有限公司；DYY-2稳压稳流电泳仪，北京市六一仪器厂；电泳槽，北京市六一仪器厂；凝胶成像系统，BIO-RAD；PCR仪，BIO-RAD；核酸蛋白测定系统，基因有限公司；

1.3 方法

1.3.1 培养基的配制

马铃薯葡萄糖琼脂培养基(PDA)：马铃薯200 g，葡萄糖20 g，琼脂10g，水1 000 mL，121℃灭菌.马铃薯液体培养基(PDB)：马铃薯200 g，葡萄糖20 g，琼脂20 g，水1 000 mL，121 ℃灭菌[6].

1.3.2 文物霉菌的复苏及纯化

在古籍特藏室取出古籍《中庸大学》，用灭过菌的棉签轻轻擦拭霉斑，并迅速将棉签放入盛有PDB的培养瓶中，28℃恒温培养箱培养.待菌落长出，进行多次划线纯化，得到纯化菌株.

1.3.3 复苏霉菌的形态学鉴定

用接种环蘸取少量之前纯化后的单菌落的孢子，接到PDA平板上，待其菌落长出，观察培养特征及显微镜观察形态特征.

参考霉菌鉴定资料，根据菌株的菌落形态、生长速率、质地、大小、颜色、培养基背面颜色变化、菌丝体和孢子的形态等特征对上述复苏、分离、纯化的菌株进行鉴定[7-9].

1.3.4 复苏霉菌的分子生物学鉴定

用试剂盒提取菌株DNA，以其为模板，NS1和NS8为引物进行PCR扩增，反应体系为50μL，具体添加量为Taq PCR Master Mix：25 μL，DNA template：1μL，引物1∶2μL，引物2∶2μL，补无菌水到50μL.PCR产物进行电泳检测并测序；以霉菌18S rDNA-ITS序列，选取其中相似度较高的几株，利用MEGA7.0软件，采用N-J法(重复度1 000)构建系统发育树[10].

1.3.5 纸质文物霉斑样品的制备

在无菌条件下，将霉菌的孢子悬液喷洒在灭菌后的宣纸上，放入恒温培养箱中培养，待纸质上形成较好的菌斑后，放入密封的干燥盒中备用.

1.3.6 复配清洗剂祛霉性能的优化

本实验室前期利用不同的生物酶作为主要的清洗剂成分对霉斑进行祛除，已经确定木瓜蛋白酶对纸质的清洗效果较好，基本达到了古籍的清洗标准，但是基于古籍的珍贵程度，加入抗坏血酸对木瓜酶清洗剂祛霉性能进行改良[11]，期望得到最佳的清洗效果.

1.3.7 清洗方法

将前期准备好的霉斑纸样从中间剪开分为清洗组与对照组，将清洗组固定在两块玻片之间，置于装有生物酶复配清洗剂的容器中，用其将霉斑纸样浸润30 min，接着用下述虹吸装置祛除掉残余的清洗剂，待其自然干燥，存放于室温、相对湿度为35%的环境中16 h后进行性能检测，见图1.

图1 清洗装置图

2 实验结果

2.1 菌落复苏结果

文章来源：《清洗世界》 网址: http://www.qxsjzz.cn/qikandaodu/2020/0828/476.html